染色體標本制備經(jīng)驗手冊
3.0版本
上海欣諭儀器有限公司
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目 錄
第一部分
人類染色體研究的實驗室建設………………1頁
第二部分
各類器械清洗與常用試劑配置………………4頁
第三部分
人類染色體標本制備方法……………………11頁
第四部分
探討染色體標本制備技術中的若干問題……22頁
第五部分
附錄……………………………………………25頁
第一部分
人類染色體研究的實驗室建設
一、實驗室要求
1、準備室（約30平方米）：供清洗玻璃儀器、配制試劑儀器包裝消毒及制片場所，還必需配置耐酸堿水池、實驗操作臺、藥櫥等設施。并能合理放置冰箱、電熱干燥箱、離心機、純水器、消毒鍋、天平等儀器，以方便使用。
2、無菌室（約25平方米）：用作細胞的接種培養(yǎng)、配備培養(yǎng)基。分為更衣室（約4平方米）、緩沖室（約6平方米）、接種室（約15平方米）。配備空調(diào)機、傳遞窗、離心機、倒置顯微鏡、超凈工作臺、臭氧發(fā)生器或紫外燈、培養(yǎng)箱等設備儀器。
3、分析室（約15平方米）：為觀察分析核型、整理資料場所。配備高清晰度帶照相裝置的顯微鏡，電腦、打印機、辦公桌等。
二、設備儀器
（一）儀器
1、超凈工作臺一臺
2、光學顯微鏡二臺（可以安裝染色體軟件分析系統(tǒng)）
倒置顯微鏡與帶照相裝置的正立顯微鏡各一臺。倒置顯微鏡用作細胞培養(yǎng)；正立顯微鏡用作核型分析，有條件的單位可配備染色體分析軟件、電腦、打印機等。
3、 隔水式恒溫培養(yǎng)箱一臺
開展產(chǎn)前檢查的單位，Z好購買二氧化碳培養(yǎng)箱。
4、電熱干燥箱一臺
5、冰箱二臺：普通冰箱和低溫冰箱各一臺
6、酸度計一臺（可略）
7、純水器（電阻率18兆歐姆）一臺；（可略）
8、高壓滅菌鍋一臺（可略）
9、電熱磁力攪拌器一臺（可略）
10、真空泵（無油）一臺（可略）
11、電子天平二臺（萬分之一天平與普通天平各一臺）
12、水平式離心機二臺
轉速0-4000轉/分，10毫升/管，大容量與小容量各一臺。大容量的供制片用，小容量的放置無菌室供細胞培養(yǎng)用。
13、 可調(diào)移液器若干支：規(guī)格從5-5000微升若干支
14、超聲波清洗器一臺（可略）
15、水浴箱（0-100℃可調(diào)）
（二）玻璃器皿與耗材
1、培養(yǎng)瓶：15毫升鏈霉素瓶，25毫升小方瓶（建議采用一次性培養(yǎng)瓶）。
2、刻度離心管（10毫升）50支
3、量筒（10-1000毫升）：各種規(guī)格各一個。
4、不銹鋼濾器（各種規(guī)格各一個）及濾膜（孔徑中0.25微米）一盒
5、注射器（1-20毫升）若干
6、鹽水瓶（100-500毫升）若干
7、試劑瓶（磨口）10個
8、蒸餾水瓶（3萬或5萬毫升）2個
9、染色缸1個
10、研缽1個
11、酒精燈2盞
12、滴管（帶吸頭）50支
13、載玻片若干
14、試管架和離心管架各2個
15、各種鑷子與剪刀若干
16、鋁飯盒（供盛培養(yǎng)瓶滴管等器械消毒時使用）
17、燒杯（容量50-2000毫升）各一個
18、抽濾瓶（1000-2000毫升）一個
19、各種規(guī)格的可調(diào)移液器吸頭若干
20、載波片盒（50-100片）若干
* 玻璃器材的材質(zhì)應采用中性硬質(zhì)玻璃或硼硅玻璃
三、常用藥品及試劑
1、培養(yǎng)基（RPMI 1640、HamF10）
2、植物凝集素（phytohemagglutinin簡稱PHA）
3、肝素鈉（抗凝劑，醫(yī)用級）
4、血清（小牛血清、胎牛血清）
5、抗菌素（青霉素、鏈霉素）醫(yī)用級
6、秋水仙素（秋水仙堿）
7、氧化鉀（分析純）
8、碳酸氫鈉（分析純）
9、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉（分析純）
10、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA，分析純）
11、三羧甲基氨基甲烷（Tris，分析純）
12、 胰蛋白酶
13、 酚紅
14、 姬姆沙染料（Giemsa）
15、 甲醇（分析純）
16、 冰醋酸（冰乙酸）（分析純）
17、 重酪酸鉀（化學純）
18、 濃硫酸（工業(yè)級）
19、 香柏油
20、 甘油（分析純）
21、 乙醇（無水和純度95%，化學純）
22、 乙醚（無水，化學純）
23、 生長因子（堿性成纖維細胞因子bFGF、表皮細胞生長因子EGF）
24、 氫氧化鈉（分析純）
25、 檸檬酸鈉（分析純）
第二部分
各類器械清洗與常用試劑配置
一、各類器械清洗處理
1、清洗液配置
清洗液配方
配方試劑 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
重鉻酸鉀（克） | 60 | 60 | 80 | 100 | 200 |
工業(yè)硫酸（毫升） | 90 | 460 | 100 | 800 | 500 |
水 （毫升） | 750 | 300 | 1000 | 200 | 500 |
方法：先將重酪酸鉀溶于水中，再慢慢加入工業(yè)濃硫酸。
注意：配制時會產(chǎn)生高熱，應采用耐高溫材料配制。配制人員要做好防護措施（如配帶保護眼鏡、耐酸手套等）貯存清洗液的容器一定要帶蓋子，防止清洗液不斷吸收空氣的水分，而變質(zhì)失效。容器的材質(zhì)可選用陶瓷或耐酸硬塑。
* 配制時切記不能將水倒入硫酸里！配方3較為廣泛使用。
2、玻璃器皿清洗
新的玻璃器皿先用清水沖干凈，再在清潔劑（如洗衣粉、洗潔精等）溶液中，用毛刷徹底刷干凈，然后清水沖凈。晾干（如有超聲波清洗器，可將器皿用清水沖凈后放入超聲波清洗器中清洗后，清水沖凈晾干）。再用5-10%HCL（濃HCL原液濃度約36%）泡過夜后，沖凈烘干，再泡入清洗液中24小時（注意泡入的器皿內(nèi)不能有氣泡），再用清水徹底沖凈，然后用蒸餾水沖凈（普通器皿沖五遍），用作細胞培養(yǎng)的器皿（如培養(yǎng)瓶等）蒸餾水沖凈后，再用三蒸水沖兩遍以上，烘干。用純棉布或無毒的硬紙包裹，高壓高溫滅菌備用。舊的玻璃儀器的清洗，可免去中間用5-10%HCL浸泡過夜這一步驟，其余的處理方法仍要保留。
3、橡膠類制品的清洗
橡膠制品（如橡膠塞等）先用清水刷洗，再用2%NaOH煮沸20分鐘，清水沖凈過透。再用2%HCL煮沸20分鐘后，自來水沖洗10分鐘，用蒸餾水過三遍后，再用蒸餾水浸泡24小時，取出80℃以下烘干，包裝消毒備用。
* 器皿的清洗是整個實驗的關鍵性的第一步。
4、載玻片的清洗處理
把玻片逐片用皂粉液洗刷干凈（用粗紗布刷，不要用毛刷）或逐片放入超聲波清洗器內(nèi)清洗后，自來水徹底沖凈后，晾干。逐片放入清洗液中浸泡24小時，取出后用自來水徹底沖凈，泡蒸餾水一天，取出放入盛有80%乙醇的容皿（帶密封蓋）內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/span>
*玻片的清潔直接影響染色體鋪展、形態(tài)及背景的清晰；玻片之間粘在一起時，密封程度高，皂液和清洗液無法侵入，故要逐片侵入。
5、金屬器材
金屬器材一般可用酒精擦凈后，高壓高溫滅菌后備用，也可用含有0.5%亞硝酸鈉的1：1000的新潔爾滅溶液中浸泡滅菌（30分鐘以上）。
二、常用試劑的配制
1、培養(yǎng)基RPMI1640配制
培養(yǎng)基由多中氨基酸、維生素、生物素、無機鹽等按不同比例配置而成，再加入酚紅作指示劑是細胞體外培養(yǎng)的必要營養(yǎng)素。
稱取10.4克RPMI1640干粉，加入新制備的三蒸水（電阻率18MΩ）900毫升，用磁力攪拌器攪拌約2小時（不能加熱），使粉末充分溶解，用NaHCO3 （約2克）調(diào)PH=7.2（用PH計測量），再用1000毫升容器瓶進行定容，在無菌室內(nèi)抽濾滅菌、分裝，于4℃冰箱保存，長時間不用，應置-20℃冰箱保存。
2、培養(yǎng)基Ham F10配制
按說明書的量稱取Ham F10干粉，配制方法和要求與RPMI1640的配制方法相同，不同之處是，用作羊水細胞的F10培養(yǎng)液體，用NaHCO3調(diào)PH=6.7。而用作外周血培養(yǎng)基的F10培養(yǎng)液，則用NaHCO3調(diào)PH=7.2。
* 配制培養(yǎng)基的蒸餾水一定要新鮮，純度達18MΩ；配好后要盡快過濾滅菌，以免細菌大量繁殖影響培養(yǎng)液的質(zhì)量。
3、抗凝劑
抗凝劑常采用的是肝素，肝素是一種多糖，能阻止白細胞和淋巴細胞與紅細胞集結在一起而影響培養(yǎng)的質(zhì)量，但肝素濃度太高會導致溶血。一般劑量是100單位肝素液可抗凝5毫升血液。
配制：取靜脈注射用肝素安瓿一支（含12500G際單位），在無菌條件下，用滅菌生理鹽水稀釋25倍即500單位/毫升，分裝備用。每管分裝0.2毫升（即100單位），可抗凝5毫升外周血。也可用肝素鈉粉劑（每毫克130單位）。取450毫升肝素鈉溶于100毫升生理鹽水，即為585單位/毫升。高壓滅菌備用。
4、植物凝集素（phytohemagglutinin簡稱PHA）
PHA是從豆子（四季豆、雞子豆、雪山豆等豆子都含有豐富的PHA）提取出來的，其化學成分為糖蛋白，具有刺激淋巴細胞進行有絲分裂的作用。PHA用量不足影響分裂細胞的數(shù)量，用量過高，則使培養(yǎng)的外周血凝集而影響淋巴細胞生長，使用前一定要清楚所使用PHA產(chǎn)品的正確用量，各廠家生產(chǎn)的PHA的活性存在著差異，故使用量有一定的差異。
配制：若購買已滅菌的PHA，可在無菌條件下直接用培養(yǎng)液（不含血清）溶解，按說明書上的使用量直接加入到培養(yǎng)液中。若購買的是未除菌的PHA粉末，則用生理鹽水溶解后，再過濾滅菌后使用。
5、秋水仙素（Colchicine,紡錘體抑制劑）
秋水仙素是從地中海的一種名叫秋水仙（colchicum）的鱗莖中提取的一種植物堿，它的作用：
（1）抑制細胞紡錘體的形成，使細胞分裂停止在中期，從而起到積累大量中期細胞的作用。
（2）使染色體單體縮短分開，呈現(xiàn)明顯的外形。秋水仙素的使用濃度范圍比較寬，可差幾十倍之多，一般終濃度為0.2-0.5微克/毫升。處理4-6小時。秋水仙素作用時間越長，被阻止的中期細胞越多，但染色體也會收縮，收縮過度會影響形態(tài)。
配制：稱取秋水仙素4毫克溶于40毫升生理鹽水，即配成100微克/毫升，高溫高壓滅菌后分裝備用，5毫升培養(yǎng)物中加入0.01毫升或0.02毫升，使Z終濃度為0.2微克/毫升或0.4微克/毫升。
秋水仙胺是人工合成的一種秋水仙素的衍生物，它的功效與秋水仙素是一樣，但對細胞的毒性作用只是秋水仙素的幾十分之一。
* 因秋水仙素具有一定的毒性和致癌作用，故配制使用時做好防護措施。
6、低滲液
低滲液的作用：能使細胞膨脹，便于染色體分散而易于觀察和計數(shù)，常用0.075M KCL作低滲溶液，優(yōu)點是：
（1）染色體輪廓較清楚
（2）染色性增強，可以縮短染色時間
（3）用于G帶技術更能顯示其優(yōu)越性
配制：稱取2.795克KCL，加雙蒸水至500毫升，溶解。4℃冰箱保存。
7、固定液
固定液的作用是穩(wěn)定染色體的形態(tài)結構，清除染色體外層物質(zhì)對染色體在玻片上展開的影響，通過更換固定液2-3次，清除紅細胞的碎片，使標本片的背景更為清晰，廣泛使用的固定液是甲醇和冰醋酸的混合物，二者的比例是甲醇∶冰醋酸=3∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配。每次固定時間至少為30分鐘，已固定的細胞在固定液中置冰箱4℃密封保存一個月也不會變質(zhì)。
8、EDTA-胰酶消化液
用于消化貼壁生長的成纖維細胞，使細胞從瓶壁脫落便于收
集或傳代培養(yǎng)。
配制：
（1）貯存液：NaCl 8克
KCL 0.4克
葡萄糖 1克
NaHCO3 0.58克
胰酶 0.5克
EDTA 0.2克
依次溶于90毫升三蒸水中，并加入1%酚紅0.2毫升作指標（也可以不加酚紅），再加入三蒸水定量至100毫升，過濾滅菌，分裝置-20℃冰箱保存。
（2）工作液：
取貯存液1毫升加無菌三蒸水或培養(yǎng)液9毫升即可，EDTAZ終濃度為0.02%，胰酶Z終濃度為0.05%，處理時間約30秒左右（應以鏡下觀察細胞變圓即可終止作用）。
9、胰蛋白酶保存液（G顯帶）
（1）0.25%胰酶液
稱取胰酶2.5克，加生理鹽水（或雙蒸水）1000毫升，充分攪拌溶解（約2小時），按每份60毫升分裝（根據(jù)G顯帶時所用的容器的容量來分，一般采用立式染片缸），冰凍保存。（使用方法見后）
（2）2%胰酶液
稱取胰酶2克，用100毫升生理鹽水（或雙蒸水）充分攪拌溶解，按每份5毫升分裝冰凍保存?zhèn)溆?。（使用方法見后?/span>
* 胰酶的配制要注意兩點：一是要充分溶解，這一過程一般會觀察到溶液由混濁變澄清；二是配制時間也不能過長，常溫下，胰酶液較容易受細菌污染，細菌數(shù)量太多，會影響胰酶效價。如果只是外用顯帶，不需要過濾除菌，但應盡快分裝，冰凍保存。盡量降低細菌的污染程度。
10.磷酸緩沖液（濃度為0.07M，PH=7.4）
人類染色體較容易被堿性染料染色，采用偏堿的磷酸緩沖液
配成姬姆薩染色液染色，使得標本片中的染色體和細胞核呈現(xiàn)鮮艷的紫藍色，其形態(tài)與帶型更為清晰。
方法：
甲液：磷酸二氫鉀（KH2PO4）9.078克加雙蒸水至1000毫升。
乙液：磷酸氫二鈉（NaHPO4·2H2O）11.876克（如果是帶12個水分子的Na2HPO4·12H2O則稱取23.87克）加雙蒸水至1000毫升溶解。
取甲溶液18.2毫升、乙液81.8毫升混勻即配成100毫升PH=7.4磷酸緩沖液。
* 上述溶液都可以配好備用。只要沒有出現(xiàn)沉淀物，勻可繼續(xù)使用。于4℃冰箱保存，使用期會長些。
11．姬姆薩（Giemsa）工作液
（1）Giemsa原液配方：姬姆薩染料 1克
甘油 50毫升
甲醇 50毫升
方法：先將姬姆薩染料加少許甘油用研缽充分研磨，逐步加入余下的甘油，置55℃水浴2小時，并不斷研磨攪勻，使其充分溶解。冷卻后，再加入50毫升甲醇混勻。置帶蓋的瓶子中（經(jīng)常搖動瓶子，使染料溶解得更好），兩周后，用定性濾紙（或普通粗濾紙）過濾即可。另一方法：將染料邊研磨邊加足甘油后，室溫下放置2天左右，期間要經(jīng)常將其攪勻，再加入50毫升甲醇攪勻，兩周后，用定性濾紙（或普通濾紙）過濾備用。此法免去了55℃毫升加熱2小時這一步驟，但配制時間較長些。
* 因甘油和甲醇具有吸水性、揮發(fā)性，原液Z好室溫下密封保存。
（2）工作液配方：姬姆薩原液:磷酸緩沖液=1:6（或以上）
* 工作液Z好現(xiàn)用現(xiàn)配，各實驗室的G顯帶方法各有差異，染料的質(zhì)量也有差異，故工作液的稀釋比例根據(jù)實際情況來定。一般情況下，濃度越高，染色時間越短；反之，則越長。過濃
稀都會影響顯帶的質(zhì)量。
12．0.2 N鹽酸溶液配制
稱鹽酸原液（約12N）HCL（AR）1毫升加雙蒸水至60毫升，攪勻即可。
13．1%或5%氫氧化鋇Ba(OH)2溶液
稱取Ba（OH）2（AR）1克或5克，加雙蒸水100毫升，加熱溶解，冷卻后若不溶物較多，可用粗濾紙過濾，4℃冰箱保存。
14．2 × SSC溶液
稱取氯化鈉NaCl(AR)17.54克，檸檬酸鈉C6H5O7Na3(AR)8.82克，加雙蒸水至1000毫升。
15．1%酚紅溶液
稱取酚紅1克，置研缽中逐漸滴加0.05NNaOH 25毫升，不斷研磨至顆粒完全溶解，再加入三蒸水至100毫升。
第三部分
人類染色體標本制備方法
一、人體外周血淋巴細胞染色體標本的制備（已經(jīng)商品化）
原理：人體外周血的淋巴細胞是一種已成熟的不具有進行有絲分裂能力的細胞，故不能直接用其制備染色體標本。但淋巴細胞在植物凝集素（PHA）的刺激下，能轉變?yōu)榫哂屑毎至涯芰Φ哪讣毎?。因此，外周血必須?jīng)過含有PHA的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，才能制備供核型分析染色體標本。
1、淋巴細胞培養(yǎng)液配制
RPMI1640液 80%
小牛血清 20%
PHA 適量（根據(jù)廠家說明書的使用量）
肝素 100單位
雙抗 100單位/毫升
細胞生長因子 適量
Z后將配好培養(yǎng)液的酸堿度調(diào)PH=7.2-7.4，在無菌的條件下進行配制分裝。然后進行分裝，每瓶4.5毫升。冰柜保存。
2、采血與培養(yǎng)
用無菌注射器吸取0.2%肝素液0.2毫升（或100單位肝素）濕潤針筒，抽取被檢者靜脈血約2毫升，輕輕轉動針筒，使之與肝素混勻，再將解凍至37℃的培養(yǎng)液的瓶蓋用酒精棉球擦凈消毒，直接用注射器從瓶蓋上插入，每瓶接種0.2-0.4毫升的外周血，搖勻后于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，如果外周血樣本不需要保留，注射器不需吸取肝素，直接抽血，立即接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)，搖勻后培養(yǎng)。這一方法減少污染機會，同時降低肝素的用量（培養(yǎng)液中已含肝素），肝素量過大，會引起溶血。
3、 秋水仙素處理
加秋水仙素的時間根據(jù)檢查目的而定。如果檢查放射損傷后
染色體畸變應在培養(yǎng)44-54小時后加秋水仙素，這樣可避免一部分畸變的染色體丟失；如果用于染色體疾病的診斷，則在培養(yǎng)66-70小時加秋水仙素，以積累更多的分裂中期細胞。
加秋水仙素的量在前面試劑配備中已討論過，這里不作探討。加入秋水仙素搖勻后，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時，終止培養(yǎng)收集細胞。
4、 低滲處理
將培養(yǎng)物倒入10毫升的刻度離心管內(nèi)，平衡離心、離心速度1000-1500轉/分，時間8-10分鐘。小心吸去上清，加入8毫升預熱37℃的低滲液，用吸管將現(xiàn)溶物打勻，置37℃水浴15-20分鐘。使白細胞膨脹，染色體分散，紅細胞解體。
5、 預固定
低滲后，立即加入1毫升新配的固定液，輕輕打勻，平衡離心、離心速度1000-1500轉/分，時間8-10分鐘。
6、 固定
離心后棄上清，留下管底的細胞，緩慢加入固定液約8毫升并輕輕打勻，37℃水浴30分鐘；第一次固定時，先加數(shù)滴，輕輕將細胞打勻，再慢慢加至8毫升，打勻，這樣染色體標本的形態(tài)較好。平衡離心、離心速度1000-1500轉/分，時間8-10分鐘。
7、 再固定
離心后，棄上清，加入8毫升固定液，打勻。于37℃水浴30分鐘，平衡離心、離心速度1000-1500轉/分，時間8-10分鐘。
8、 制片
離心后，棄上清，根據(jù)沉淀的細胞量，加入適量的固定液打勻，將細胞懸液滴入1-2滴于預凍的干凈玻片中央，隨即吹氣，輕輕過火，氣干。
* 注意事項：
①器皿洗滌一定要干凈，不能有酸堿殘留。
②接種外周血不能太多或太少
③培養(yǎng)細胞溫度37℃+ 0.5
④秋水仙素一定要避光保存，配制后使用期不能超過半年，
秋水仙素的處理時間不要少于4小時，也不要超過6小時。
⑤低滲的時間、溫度會影響染色體的分散和分裂相的數(shù)目。
⑥離心機Z好用水平式，轉速過快過慢直接影響標本片的質(zhì)量。
⑦固定液一定要現(xiàn)用現(xiàn)配，固定要徹底，每次不少于30分鐘，加固定液不能過快，要沿管壁慢慢加入，否則染色體容易扭轉；固定作用不足，染色體出現(xiàn)毛刷狀。
⑧玻片的清潔度、冷凍溫度會影響染色體的鋪展
二、骨髓染色體標本的制備
骨髓染色體標本制備通常用于白血病患者，特別是急慢性粒細胞的白血病的檢查，也適用于淋巴細胞性白血病。骨髓細胞處于生長分裂期，可以直接取樣制備染色體標本片，為了增加細胞的分裂相數(shù)量，可在加入秋水仙素的培養(yǎng)液中作短暫的培養(yǎng)。再收集細胞制備染色體標本片，會獲得較滿意的分裂相數(shù)目。
1、骨髓細胞短期培養(yǎng)法
培養(yǎng)液配方：RPMI 1640 80%
小牛血清 20%
雙抗 100單位/毫升
肝素 100單位
配好后分裝成每瓶5毫升，冰凍保存，用滅菌的注射器從髓骨抽取骨髓液0.2-0.4毫升，直接注入預熱37℃的培養(yǎng)液中搖勻，37℃培養(yǎng)24-48小時后，加入秋仙素（10微克/毫升）0.1毫升，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時，終止培養(yǎng)收集細胞。
低滲、固定、制片等步驟與外周血染色體標本制備相同。
2、骨髓細胞直接制片法
用滅菌的注射器從隋骨抽取骨髓液0.3-0.5毫升，立即注入含秋仙素0.1-0.05微克/毫升的生理鹽水（5毫升）中，用滴
管輕輕吸動，將骨髓的脂肪顆粒充分洗掉，平衡離心速度1000-1500轉/分，時間8-10分鐘，棄上清。加入含同樣秋水仙素濃度的生理鹽水2-3毫升，37℃放置2-3小時，平衡離心，時間速度同上，棄上清。加低滲液5毫升，打勻后37℃水浴10-15分鐘，離心棄上清，固定、制片的方法按外周血染色體標本制備進行。
3、注意事項：
（1）骨髓染色體標片制備的成敗，首先取決于骨髓液，抽取骨髓太少或太稀，細胞數(shù)量過少，不易獲得較多的中期細胞，要進行核型分析就更困難了。故要足夠的骨髓量和細胞數(shù)。細胞數(shù)量要求達3×106/毫升。通常作短期培養(yǎng)能增加細胞數(shù)目，提高成功率。
（2）骨髓材料中脂肪顆粒較多，必須充分洗掉，否則影響標片的質(zhì)量。
三、羊水細胞染色體標本的制備
羊水細胞染色體標本制備技術，目前已廣泛應用到臨床產(chǎn)前檢查中。羊水中的細胞量少，且大多是老化細胞，因此不能直接制備染色體標本，羊水細胞的培養(yǎng)是實驗成功的關鍵。
1、羊水穿刺取材：（略）
在有條件的醫(yī)院，由專業(yè)醫(yī)生在無菌安全條件，準確定位，取出羊水20-30毫升。
2、羊水細胞培養(yǎng)：
培養(yǎng)液配方：Ham’s F10培養(yǎng)液 80%
胎牛血清 20%
細胞生長因子 適量
雙抗 100單位/毫升
調(diào)PH=6.6-6.8，無菌條件配制，分裝冰凍備用。抽取的羊水在無菌條件下，平衡離心，離心速度1000-1200轉/分鐘，時間8-10分鐘，棄上清，留下1毫升上清與沉淀的細胞打勻，接種到25毫升方形的培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入5毫升預熱37℃的羊水培養(yǎng)液，輕輕打勻，置37℃培養(yǎng)箱（Z好采用CO2培養(yǎng)箱）。靜止培養(yǎng)6-7天。接種量，通常10毫升羊水的細胞接種一瓶。
3、6-7天后，鏡下觀察細胞生長情況，若羊水細胞已貼壁，并形成許多細胞小島，即進行換液。
4、換液時，輕輕吸去舊的培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)液5毫升
5、細胞換液后生長加快，隔日觀察，當細胞生長旺盛，出現(xiàn)許多透亮圓形飽滿的細胞時（一般約為14-30天），可收集細胞進行染色體制片。
6、若換液后，細胞生長緩慢，仍舊只有幾個孤立細胞小島，或者細胞形態(tài)只有成片的樹皮狀的細胞，無圓形的細胞出現(xiàn)。就要進行原瓶傳代或換瓶傳代：倒去培養(yǎng)液，加入1-2毫升EDTA胰酶，于37℃作用1-2分鐘，輕輕吸去胰酶液，加入5毫升培養(yǎng)液，輕輕將細胞打勻，或換上新瓶或用原來的瓶，37℃靜止培養(yǎng)，3天后觀察細胞，細胞生長旺盛，出現(xiàn)較多雙圓形細胞時可進行染色體制片。
7、收集細胞前5-6小時，加入秋水仙素，終濃度為0.1微克/毫升，或或收集細胞前16-18小時，加入秋水仙素，終濃度0.02-0.05微克/毫升，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。
8、倒去培養(yǎng)液，加入EDTA胰酶1-2毫升。鏡下觀察胰酶作用情況，當細胞收縮變圓時候，立即輕輕倒去胰酶，加入5毫升生理鹽水，輕輕將瓶壁的細胞吹打脫落，平衡離心速度1000-1200轉/分。時間8-10分鐘。棄鹽水上清。然后進行低滲處理，低滲、固定、制片等步驟與外周血染色體標本制備基本相同，所不同的是，低滲液、固定液的每次使用量每管3-5毫升，以減少細胞損失。由于羊水細胞易破，故操作的力度一定要輕，只能用氣吹打，不能吸打。
* 注意事項：
①抽取妊娠16-20周的羊水Z好，月份過小羊水不足，月份過大羊水細胞老化不易培養(yǎng)成功。
②抽羊水前翻動孕婦的身體，以取得較多的羊水細胞。
③培養(yǎng)液的胎牛血清的質(zhì)量十分關鍵。
④培養(yǎng)開始4天內(nèi)不要翻動，以免影響細胞貼壁
⑤收集細胞的時機要掌握好，生長不夠旺盛的，形態(tài)成樹皮狀的細胞收不到分裂相，只有生長旺盛且呈現(xiàn)較多圓形透亮的細胞時，才能收到較多的中期細胞。
四、染色體顯帶技術
染色體顯帶技術常用的有熒光Q-帶、Giemsa G-帶、異染色質(zhì)的C-帶等。這里介紹較為常用的Giensa G -帶C-帶技術。
1、G-顯帶染色體標本的制備
方法一：
（1）將配制好的0.25%的胰蛋白酶溶液60毫升倒入立式染色缸內(nèi)，37℃水溶預熱，用3% Tris調(diào)PH=7
（2）將標本片浸入胰酶溶液中，不斷輕輕擺動，新鮮標本只需處理3-9秒鐘，老標本則需處理3-5分鐘。
（3）立即投入1：10或1：20的Giemsa工作液，染色15-20分鐘
（4）自來水沖凈，氣干。
方法二：
（1）45毫升生理鹽水或雙蒸水倒入立式染色缸內(nèi)，加入已配好的2%胰酶液5毫升，用3% Tris溶液調(diào)PH=7于37℃預熱。
（2）把染色體標本片浸入37℃上述胰酶工作液中，略加搖動，處理30秒左右。
（3）取出后立即用1：10Giemsa工作液染色8-10分鐘，自來水沖凈。
* 注意事項：
①胰酶的品質(zhì)會直接影響顯帶的質(zhì)量，購買品牌試劑較保險。
②胰酶的活性與PH值和溫度有關，在PH=7溫度37℃狀態(tài)
下，胰酶活性Z高。
③胰酶處理時間長短與標本片片齡有關，新鮮的標本處理時間短，且?guī)Ъy較清晰，建議標本片的片齡在2-7天內(nèi)較適宜。
④Giemsa工作液要現(xiàn)用現(xiàn)配
⑤胰酶工作液長時間置37℃水浴，容易渾濁污染，應棄之。
2、C-帶染色體標本的制備
C顯帶特點：對染色體中的結構性異染色質(zhì)容易染色，對常染色質(zhì)只能顯示較淡的輪廓。C顯帶所顯示著色較深的結構部位：①各染色體的著絲粒；②各近端著絲粒的部位；③在1、9、16號染色體具有次縊痕的位置上；④Y染色體的長臂遠端，此部分系Y染色質(zhì)部分。其它部分著色很淡。
核型分析過程，對某些染色體變異問題，往往需要C顯帶技術與G顯帶技術結合分析，更能準確判斷染色體的畸變。
方法一：
（1）將常規(guī)制備染色體標本片放入0.2NHCL溶液中，室溫下，處理15-30分鐘。
（2）自來水沖凈后，再將標本片浸入預溫到65℃的5% Ba(OH)2溶液中，處理10分鐘。
（3）自來水沖凈后，再把標本片投入預溫到65℃的2×SSC溶液中，處理1-1.5小時；
（4）自來水沖凈后，用1：10 Giemsa工作液染色0.5-1小時。
（5）自來水沖凈，氣干。
方法二：
（1）將制好的標本片放入0.2N HCL中，室溫下1小時。
（2）水洗凈（均用自來水沖洗）
（3）浸入1% Ba(OH)2水溶液中，溫度預熱到50℃，處理時間15-20秒。
（4）水洗凈
（5）浸入預溫到60℃的2×SSC溶液中，處理90分鐘。
（6）用水徹底沖凈；
（7）1：10 Giemsa染色液染色10-15分鐘
（8）水沖凈、氣干。
* 注意事項：
①標本片年齡不能超過一個月
②各種處理溶液一定要達到所需的溫度時，才放入表本片進行處理
③每一步處理后，要立即用自來水徹底沖凈后，才進行下一步處理。
3、R帶技術
（1）試劑
①pH6.8PBS：溶液A——1/15mol/LKH2PO4、溶液B——1/15mol/LNa2HPO4。pH6.8PBS為1000毫升A液加900毫升B液。
②Earles液：溶液A—NaCl6.80克、KCl0.40克、NaH2PO4·H2O0.14克、蒸餾水800毫升。
溶液B—無水CaCl20.20克、MgCl·6H2O0.17克、蒸餾水200毫升。
將溶液A倒入溶液B中，混合后即可。
③Hoechst-33258原液：Hoechest-332582毫克，蒸餾水4毫升。
Hoechest工作液：200毫升1/15mol/LPBS加0.75毫升原液。
④吖啶橙（acridineorange）
配制pH6.5PBS：
溶液A——0.07mol/LNa2HPO4·12H2O、溶液B——0.07mol/LKH2PO4。將32毫升A液和68毫升B液混合。
吖啶橙工作液：0.1克吖啶橙于100毫升0.07mol/LPBS中。
⑤胸腺嘧啶核苷（Thymidine）：使Z終濃度為每毫升為0.3毫克。
⑥5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）：使Z終濃度為3×10-5mol/L。
2.顯帶步驟
（1）所制標本在Hoechst工作液中，浸染20分鐘或在吖啶橙工作液中浸染5分鐘，再用PBS沖洗2次。
在同步比培養(yǎng)細胞時，進行BrdU處理，使BrdU在DNA復制時滲入到胸腺嘧啶的位置，又因BrdU是一種淬滅劑，凡有BrdU的區(qū)域都能使吖啶橙和Hoechst熒光染料減弱，這對于顯帶清晰有幫助。
（2）標本上鋪滿1/15mol/LPBS，放在45℃鐵板上，用8W紫外燈，燈距為5厘米，照射15—20分鐘后，蒸餾水洗2次。
紫外光的照射造成鄰近胸腺嘧啶形成二聚體，即TT，這樣減少了AT間的氫鍵，使富于AT的DNATm值下降，也就是這部分的DNA更易變性。
（3）標本在86℃水浴鍋中的Earles液中處理1—2分鐘后，蒸餾水洗2次。處理時間和氣溫及標本齡、光照有關。
R顯帶過程中的熱處理是重要的步驟，86℃是適宜的溫度，使富于AT的DNA變性而使富于GC的DNA保持原狀。
（4）用pH6.8PBS配制5％Giemsa染色5—10分鐘，水洗，空氣干燥。
（5）在顯微鏡高倍目鏡下檢查顯帶標本（見圖26-1，C），R帶是與G帶相反的帶型，R帶是富于GC堿基對的DNA，是S期早復制的DNA，而其帶間是富于AT堿基對的DNA，是S期晚復制的DNA。在顯微鏡下可以看到比G帶更明顯的帶型，另外大部分染色體端部為深染，還有若兩條X染色體中的一條為晚復制時，呈淡染。這對于染色體間易位和對X染色體失活和晚復制關系的研究將有D特的功能。若在顯微鏡下呈現(xiàn)一片淡染，可考慮光照時間和處理時間兩者之比例。
4、染色體脆性位點顯示技術
（1）試劑
①培養(yǎng)液：93毫升mol/L199＋5毫升透析小牛血清＋1毫升2mol/LHepes＋1毫升10-5mol/LFUdR＋2×104單位青霉素、鏈霉素，pH7.6—7.8。
②氨甲喋呤（amethopterin），使Z終濃度為10-7mol/L。
③BrdU，使Z終濃度達3×10-5mol/L。
④秋水酰胺，Z終濃度為每毫升0.07微克。
（2）標本制備
人體培養(yǎng)細胞在培養(yǎng)瓶中匯合三分之二時，淋巴細胞培養(yǎng)至72小時，加入氨甲喋呤，Z終濃度為10-7mol/L，繼續(xù)進行同步化培養(yǎng)17小時，用Hanks液清洗2次，加入新鮮培養(yǎng)液，在淋巴細胞換入的培養(yǎng)液中仍需含有PHA，但在換入培養(yǎng)液去掉FUdR，而加入BrdU，Z終濃度達3×10-5M，繼續(xù)培養(yǎng)5小時，隨即加入秋水酰胺，Z終濃度為每毫升0.07微克，2小時后按常規(guī)收細胞，空氣干燥制片。
（3）顯示脆性位點：用pH6.8PBS配制3％Giemsa染色10分鐘，水洗，空氣干燥。
（4）鏡檢：在顯微鏡高倍目鏡下觀察100個分裂中期有3—30個染色體上發(fā)現(xiàn)有脆性位點（見圖26-1，D），主要特征為具有寬度不等的非染色裂隙，常涉及兩個染色單體，此外，可出現(xiàn)無著絲粒片段缺失以及三相交換體征象（friradialfigure）。脆性位點可能是富含胸腺嘧啶的DNA節(jié)段，因此當脫氧胸苷三磷酸庫（dTTP）耗竭時，可造成這一節(jié)段在有絲分裂時不能緊密折疊，甚至出現(xiàn)裂隙或斷裂，表現(xiàn)出鏡下可見的脆性位點。如在細胞培養(yǎng)液中去除葉酸和胸腺嘧啶，或加入二氫葉酸還原抑制劑（如氨甲喋呤）和5-氟脫氧尿嘧啶核苷（FUdR）、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU），可使脆性位點細胞表達頻率明顯增高，說明脆性位點的產(chǎn)生與DNA的這一合成代謝過程受阻有關。此外培養(yǎng)液的pH對提高脆性位點的檢出率是非常重要的。因為在不同pH條件下，葉酸具有不同的離子形式，其進入細胞的運轉速率也就不同，而胸腺嘧啶的攝入同樣受pH的影響，因此在選擇適當培養(yǎng)液的同時注意pH的影響。
5、Giemsa分化染色技術
（1）試劑：Giemsa原液制備（參見P8）：
（2）標本制備
常規(guī)制片，細胞懸液滴片時為一般片的1/3密度。用乙
醇-0.2mol/LHCl洗一下標本。
(3) 顯色過程
①標本浸在60℃蒸餾水中2小時。
②制備染色液，47毫升pH11.3，0.05mol/LPBS＋3毫升Giemsa原液，混和后用濾紙過濾，在37℃水浴鍋中預溫。
③標本浸到37℃Giemsa染液中1—6分鐘、標本齡長時適當延長染色時間。
④鏡檢：在顯微鏡高倍目鏡下觀察，靈長類的染色體呈現(xiàn)淡藍色，伴有一些特定的異染色質(zhì)呈品紅色。嚙齒類染色體會被染成品紅色。
五、實驗結果
通過染色體分化染色，可以在染色體上顯示出各種帶型及脆性位點，有利于對染色體遺傳病的診斷，尤以X染色體長臂末端2區(qū)7帶和2區(qū)8帶之間或附近的一個特定脆性位點，它表現(xiàn)了非特異性X連續(xù)的智力低下，被稱為脆性X染色體綜合癥，可以給于葉酸治療，這一發(fā)現(xiàn)將會使許多不明原因的智力低下患者得以診斷和治療。Giemsa11帶又可用于人類細胞和嚙齒類細胞融合后所得雜種細胞的檢定。再者染色體分化染色一般公認為是DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，而且顯帶是一種染料特異現(xiàn)象，為此染色體分化染色不僅是一個具有巨大價值的實用手段，而且對染色體組成的特定水平也將提供重要資料。
第四部分
探討染色體標本制備技術中的若干問題
1、為什么有的培養(yǎng)基的顏色較深，有的較淺？
答: 培養(yǎng)基的紅色來自成分中的酚紅，因為它的變色范圍較適合作培養(yǎng)基的酸堿度指示劑。它在PH≥7時，顏色由紅變深紫色，PH≤7時，顏色則由紅色逐漸變成黃色。外周血的培養(yǎng)液PH=7.2-7.4。另外，不同廠家出廠的同一種培養(yǎng)基，因配方的酚紅含量各有差異，使培養(yǎng)液的紅色深淺略有差異，但不影響培養(yǎng)效果。
2、為什么外周血培養(yǎng)時間要68-72小時？
答: 外周血淋巴細胞在體外培養(yǎng)中，受到培養(yǎng)液中的PHA刺激，獲得有絲分裂能力，經(jīng)過68-72小時的培養(yǎng)后，大多數(shù)淋巴細胞進行了三次分裂增殖，數(shù)目達到制備標本片的要求。培養(yǎng)時間過短，細胞量不足，培養(yǎng)時間過長，細胞老化，營養(yǎng)耗盡，又浪費時間。實驗證明，68-72小時的培養(yǎng)，效果Z為理想。
3、有的標本片，分裂相很多，但染色體“瘦小”，是不是培養(yǎng)液營養(yǎng)不良引起？
答: 淋巴細胞一定要在良好的營養(yǎng)環(huán)境中才能生長增殖，分裂相多，說明了淋巴細胞生長旺盛，染色體“瘦小”，是因為在制片過程中，染色體的蛋白結構發(fā)生異固縮造成的，起因可考慮為以下幾個原因：
① 秋水仙素濃度是否過高，或處理時間是否過長？
② 加固定液的速度不要過快，有時瞬間的固定，會使蛋白結構產(chǎn)生固縮現(xiàn)象。
③ 固定液中的甲醇、冰醋酸是否有質(zhì)量上的改變。
④ 可以適當加大固定液中的冰醋酸的比例，如甲醇∶冰醋酸=3∶1.5（或2）
4、配備好的培養(yǎng)基一般能保存多長時間？
答: 培養(yǎng)基保質(zhì)期與貯存溫度有關，貯存溫度在-20℃（普通冰
箱冰格層）可以保存半年至1年；貯存溫度在-70℃以下，可以保存1-2年。
5、培養(yǎng)基的接種溫度對細胞培養(yǎng)有影響嗎？
答: 接種前，應該將培養(yǎng)基預熱至37℃才接種。若培養(yǎng)基接種溫度低于4℃，容易造成細胞破裂（尤其是紅血球）。影響培養(yǎng)效果；另外培養(yǎng)基的接種溫度如果低于10℃，往往造成細胞進入半休眠狀態(tài)，影響細胞培養(yǎng)周期，使分裂相減少。
6、抽取的外周血是否需要抗凝？
答: 我們配制的培養(yǎng)基已含有肝素，若待檢的樣品可以立即接種不需保留的，抽血時不需添加抗凝劑。方法是將抽取的外周血立即接種到培養(yǎng)液中，馬上搖勻后放到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。若待檢的樣品不能馬上接種或要保留樣品的，應抽血前加入適量的抗凝劑，抽完血后馬上搖勻，再進行接種。
注意：抗凝劑過多會影響培養(yǎng)效果（在前面的試劑介紹中已討論過）。
7、抽取的血液樣本能保留多長時間？
答: 首先強調(diào)的是，外周血的樣品越新鮮培養(yǎng)效果就越好，一些特殊病例需要保留樣品作備用，應將添加過抗凝劑的外周血樣品放在4℃-10℃冰箱中保存，保存期為3天左右。超過七天后接種，培養(yǎng)效果很差。
8、經(jīng)制片后的細胞懸液能保存多長時間？
答: 細胞懸液可密封后保存在4℃或－20℃，4℃保存一個月內(nèi)，－20℃保存2年內(nèi)滴片制成的標本片仍可進行G顯帶；－20℃保存3年細胞懸液仍可進行熒光雜交。
9、為什么外周血培養(yǎng)過程中有時會出現(xiàn)凝血現(xiàn)象？
答: 在實驗過程中下列原因可能會導致培養(yǎng)后的血液出現(xiàn)凝血現(xiàn)象：
①培養(yǎng)液中的PHA含量過高。
②培養(yǎng)液中的肝素使用量不足或效價下降。
③接種后，沒有立即降外周血與培養(yǎng)液充分搖勻。
10、為什么外周血培養(yǎng)有時會出現(xiàn)溶血情況？
答: 在實驗過程中下列原因可能會導致培養(yǎng)后的外周血溶血：
①細菌污染。
②PHA和肝素過量。
③外周血樣品不新鮮。
11、為什么有個別樣品出現(xiàn)不明原因的無分裂相的現(xiàn)象？
答: 由于有個別病人可能服用過抑制白細胞分裂增殖的藥品（如白血病病人），這類病人的樣品往往經(jīng)培養(yǎng)后，白細胞仍受到藥物抑制而不進行分裂增殖，因此標本片很難找到分裂相，建議停藥一個月以上再作染色體檢查。
第五部分
附 錄
一、染色體實驗應用
1．姐妹染色體交換核型分析
2、職業(yè)病等微核分析
3、染色體遺傳病分析
4、白血病病人診斷參考分析
5、細胞生物學教學
6，染色體脆性觀察
二、染色體實驗用品報價單
組建染色體實驗室和染色體分析系統(tǒng)請參考公司網(wǎng)站。
三、 聯(lián)系方式
網(wǎng)址: http://jiamingtc.cn 郵箱：sj_gy17@163.com
電話： 021-51093712
